文章以氮高效转基因水稻OsNRT 2.3b 两个有所不同株系N-04 和N-08 为研究对象，以非转基因亲本日本斋藤（Nipp）为对照，在田间小区试验条件下，设施氮和不施氮两种处置，使用变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）技术，分析了氮高效转基因水稻在生长期对土壤氨水解细菌群落多样性的影响。section 38= wx_fmt=png) padding:= border-width:=研究找到，水稻土壤氨水解细菌非常丰富度指数在各生长期内品种间皆不不存在明显差异。
两种处置条件下N-04 的土壤氨水解细菌香农-威纳指数仅有在拔节期与Nipp 有明显差异，其余生育期皆无明显差异；在舒氮条件下N-08 的土壤氨水解细菌香农-威纳指数在拔节期和抽穗扬花期与Nipp 不存在明显差异，不施氮条件下仅有拔节期经常出现明显差异。两种处置条件下，N-04 的土壤氨水解细菌均匀度指数与Nipp 比起整个生长期皆无明显差异，而N-08 在拔节期明显高于Nipp。
测序结果表明，施氮和不施氮处置下氮高效转基因水稻（N-08 和N-04）与Nipp 比起土壤中享有更好的亚硝化螺旋菌科（Nitrosospira）和亚硝化单胞菌科（Nitrosomonas）。研究指出，氮高效转基因水稻在个别生育期对香农-威纳指数和均匀度指数有明显差异，且其更加不利于增进土壤铵态氮向硝态氮的转化成。前言从1996 年到2015 年，全球转基因作物总计栽种面积超过空前的20 亿hm2，转基因作物早已沦为现代农业史上推展尤为很快的农作物，但转基因作物在给人们带给极大经济效益的同时，其所带给的生态安全性问题也日益引发公众的普遍注目，特别是在是对土壤微生物群落多样性的影响。
有研究指出，转基因棉花的栽种能使土壤细菌和真菌的数量明显增加，使其群落构成发生变化，也有文献报导转基因作物的栽种并未对土壤微生物群落结构产生明显影响。然而，要更加了解评价转基因植物对土壤微生物的影响，在研究分析整体微生物群落的过程中，还不应研究转基因植物对土壤命令性微生物的影响。氨水解细菌作为微生物生态学研究的命令性微生物，同时也是继续执行硝化作用第一步（将氨水解为亚硝酸盐即硝化速率限制性步骤）的关键微生物，在土壤氮素循环中占据最重要地位，但其群落构成更容易不受气候条件、土壤利用方式和植被类型等的影响，因此受到涉及领域科学家的普遍注目。
氮高效转基因水稻OsNRT 2.3b 是利用转基因技术将水稻高亲和硝酸盐运输蛋白OsNRT 2.3b 基因引入受体而取得的超强传达材料。Fan 等和唐仲研究找到，与常规稻比起，OsNRT 2.3b 超强传达株系中累积的氮素总量提升了21%，铵态氮吸取速率提升了12%，氮素利用效率提升了40%，单株产量提升了30%。
由于土壤氮循环长年正处于一个动态平衡的状态，氮高效转基因水稻的栽种势必会从土壤中吸取更好的氮素，转变土壤氮素动态特征，进而有可能影响土壤氨水解细菌群落结构。本研究使用PCR-DGGE 技术，以氮高效转基因水稻OsNRT2.3b 的两个有所不同株系N-04 和N-08 为对象，研究其土壤氨水解细菌16S rDNA 基因群落结构及多样性构成，为科学评价氮高效转基因水稻对土壤微生物的影响获取理论依据。1 材料与方法1.1试验地概况与试验设计试验在农业部环境保护科研监测所网室内展开，栽种小区四周及底部为混凝土结构，内部长、长、低皆为1 m，小区内土壤为天津市津南区并未栽种过作物的潮土，仅有磷含量1.19 g·kg-1，全氮含量0.96 g·kg-1，有机质含量24.55 g·kg-1，pH 8.21。试验使用几乎随机区组设计，设施氮和不施氮两种处置，5 次反复。
氮源（20 g·m-2）为尿素[CO（NH2）2]，其中50%用于基肥，50%不作追肥，追肥在水稻分蘖后期用药。分别以磷酸二氢钾（P2O5：15 g·m-2）和硫酸钾（K2O：18 g·m-2）作为磷肥和钾肥，全部用于基肥。1.2供试材料试验所用水稻为氮高效转基因水稻OsNRT 2.3b的两个有所不同株系N-04 和N-08 及非转基因亲本日本晴Nipp，皆由南京农业大学资源与环境科学学院植物营养分子生物学实验室获取。
水稻种子于2015 年5 月8 日采收于培育盘中，每穴5 粒，于6 月25 日移苗，挑选出长势完全一致的水稻苗，每个小区内修剪水稻20 株。1.3土壤样品收集分别于水稻分蘖期（7 月27 日）、拔节期（9 月8日）、抽穗扬花期（10 月10 日）和成熟期（11 月12 日）收集土样。收集土样时，除去表面杂草和枯枝落叶，用直径3.5 cm 的土铁环在距水稻主茎2 cm 处取20 cm 浅的土样，每小区3 个采样点。
将各个小区的样品分别混合，置放-20 ℃冰箱，用作土壤氨水解细菌群落多样性分析。1.4测定方法1.4.1土壤微生物总DNA 萃取本研究使用Mo Bio 公司的Powerlyzer powersoilDNA isolation kit（Mo Bio laboratories，Solana Beach，CA，USA）试剂盒，所取0.5 g 鲜土置放Glass Bead Tube 中，按操作者解释逐步展开萃取，将萃取到土壤的DNA 用1.5%的琼脂糖凝胶检测样品质量，并于-20 ℃留存。1.4.2PCR 扩充使用巢式PCR（Nested PCR）方法扩充氨水解细菌16S rDNA 基因序列，引物及反应条件闻表格1。第一轮PCR 反应产物大小为465 bp，PCR 反应体系为50 μL（两种引物各0.5 μL，Premix Ex Taq 25 μL，溶解2 倍的土壤DNA 模板5 μL，用消毒水补充至50μL）；第二轮PCR 反应产物大小为250 bp，PCR 反应体系为50 μL（两种引物各0.5 μL，Premix Ex Taq 25μL，第一轮PCR 产物5 μL，用消毒水补充至50 μL）。
1.4.3变形梯度凝胶电泳（DGGE）检测及条带重复使用PCR 产物使用Bio-Rad 公司的DcodeTM 标准化变异检测系统（Bio-Rad，USA），按照操作者解释展开检测。主要步骤如下：浓度为8%的聚丙烯酰胺，变性梯度为40%~60%（100%变性剂所含7 mol·L-1 尿素和40%（V/V）去离子甲酰胺），60 ℃加压，将30 μL PCR产物（与loading buffer 实混好）重新加入胶孔，先在60 ℃、60 V 恒定电压下预跑30 min，然后在60 ℃、150 V 电泳6 h。
电泳完后用SYBR Green Ⅰ（1∶10 000）染色30 min，再行用Gel Dox XR 凝胶光学系统（Bio-Rad）展开仔细观察与照片，挑选主要条带割胶重复使用。1.4.4条带提纯克隆及测序核对重复使用后的条带用不带GC 夹子的338f 和518r 引物展开扩充，PCR 产物经过电泳分析确认为单一条带后，使用Wizad R SV Gel and PCR Clean-Up system 试剂（Progema，USA）提纯，并与载体pGEM -T EasyVector（Progema，USA）相连转化成（4 ℃培育8 h），挑取培育后的白色菌落疫苗到LB 液体培养基中，37 ℃摇床培育8 h，阳性克隆送来出有测序。测序结果在NCBI 上经Blast 核对分析，取得相似典型菌株序列。1.5数据分析使用SAS 9.1.3（Tukey′s test）对试验数据展开分析，Quantity One 4.6.2 软件展开数字化处置并展开聚类分析。
土壤氨水解细菌16S rDNA 基因多样性使用香农-威纳指数（Shannon-Wiener index，H）、均匀度（Evenness index，En）和非常丰富度（Richness，S）来评价，其计算公式如下： H=-ΣPilnPiEn=H/lnS式中：H 代表香农-威纳指数；Pi 代表第i 条带占到总强度的比值；En 代表均匀度指数；S 代表非常丰富度指数。2 结果与分析2.1土壤氨水解细菌16S rDNA 基因DGGE 图谱分析DGGE 结果表明，各生长期N-04、N-08 和Nipp在舒氮和不施氮处置条件下DGGE 指纹图谱多为共计条带，只有少部分归属于差异条带。在舒氮条件下（图1），N-04 仅有在拔节期与Nipp 有2 条差异条带（1B-2 和1B-4）；N-08 在分蘖期、抽穗扬花期和成熟期与Nipp 有4 条差异条带（1A-3 和1A-5；1C-4；1D-5）。
不施氮处置条件下（图2），N-04 在分蘖期、抽穗扬花期和成熟期与Nipp 各有1 条差异条带（2A-2；2C-5；2D-4）；N-08 在4 个生长期与Nipp 共计8 条差异条带（2A-5 和2A-7；2B-1；2C-3、2C-4、2C-6 和2C-8；2D-6）。2.2土壤氨水解细菌16S rDNA 基因多样性分析根据DGGE 指纹图谱中每条条带的灰度比率，对栽种N-04、N-08 和Nipp 的土壤氨水解细菌16SrDNA 基因非常丰富度指数（S）、香农-威纳指数（H）和均匀度指数（En）展开分析。
结果找到，在舒氮和不施氮条件下，N-04 和N-08 的土壤非常丰富度指数与Nipp 在各生长期内皆并未经常出现明显差异（表格2 和表格3）。施氮条件下，N-08 的土壤氨水解细菌香农-威纳指数在拔节期时明显高于Nipp，而在抽穗扬花期明显低于Nipp，N-04 的在分蘖期、拔节期和成熟期皆并未经常出现明显差异，仅有在抽穗扬花期明显高于Nipp（表格2）；不施氮条件下，N-08 的土壤氨水解细菌香农-威纳指数在分蘖期、抽穗扬花期和成熟期皆并未经常出现明显差异，仅有在拔节期明显低于Nipp，N-04 除抽穗扬花期明显高于Nipp 外，其余各时期与Nipp 皆无明显差异（表格3）。
在舒氮和不施氮条件下，N-04 各生长期土壤氨水解细菌均匀度指数与Nipp 皆无明显差异（表格2）；N-08 仅有在拔节期明显高于Nipp，其余生育期并未与Nipp 产生明显差异（表格3）。2.3土壤氨水解细菌16S rDNA 基因测序结果及系统发育分析根据土壤氨水解细菌DGGE 指纹图谱（图1 和图2）及条带灰度比率值大小，在舒氮条件下挑选32条条带上，不施氮条件下挑选29 条条带上，展开克隆测序，报请NCBI 序列核对分析。结果找到各挑选条带与未知序列相近度皆在96%~100%之间（表格4 和表格5），将测序取得的基因序列与Genbank 其他相近序列对比，绘制系统发育树根并展开系统发育分析（图3 和图4）。从系统发育树根可以显现出，施氮处置条件下32 个阳性克隆和不施氮处置条件下29 个阳性克隆主要归属于不能培育β-变形菌纲（Uncultured beta proteobacterium）、亚硝化螺旋菌科（Nitrosospira sp.）和亚硝化单胞菌科（Nitrosomonas sp.），其中N-08 的优势科为亚硝化螺旋菌科（Nitrosospira sp.），N-04 和Nipp 的优势科皆为不能培育β-变形菌纲（Uncultured beta proteobacterium）。
根据土壤氨水解细菌DGGE 指纹图谱及条带核对结果找到，在舒氮处置条件下，各生长期内N-08归属于β-变形菌门的亚硝化单胞菌科（Nitrosomonassp.）的条带共计6 条，归属于β-变形菌门的亚硝化螺旋菌科（Nitrosospira sp.）的有3 条，N-04 归属于上述菌属的条带共计6 条，而Nipp 有5 条（表格4）。不施氮条件下，N-08 归属于β-变形菌门的亚硝化单胞菌科（Nitrosomonassp.）和亚硝化螺旋菌科（Nitrosospira sp.）的条带共计6 条，N-04 则有5 条，Nipp 仅有1 条归属于亚硝化螺旋菌科（Nitrosospira sp.）的条带，并未找到归属于亚硝化螺旋菌科（Nitrosospira sp.）的条带，且该条带归属于三种水稻品种共计条带（表格5）。由此可以显现出，N-08 和N-04 归属于亚硝化螺旋菌科（Nitrosospira sp.）和亚硝化单胞菌科（Nitrosomonas sp.）的条带数量明显低于Nipp。
3 辩论目前关于转基因水稻生态环境安全性评价的研究主要集中于在基因飘移、靶标及非靶标生物的影响以及农业生态环境等方面。转基因生物获释后否对土壤微生物产生影响，近年已沦为研究热点。陈丽华等研究找到抗真菌转基因水稻秸秆水解对土壤细菌数量的影响不明显，且转基因土壤样品与非转基因土壤样品中土壤细菌的非常丰富度、多样性指数、均匀度指数皆不不存在明显差异。
但陈晓雯等却找到并转Cry1Ac 基因和并转Cry1Ab 基因水稻在生长充沛时期，土壤中细菌数量明显低于非转基因亲本水稻，不过这种影响的持续时间较短。陈丽华等也证实了广谱抗真菌蛋白转基因水稻秸秆水解对土壤可培育真菌数和真菌群落结构有影响，但所产生的影响是一段时间的、不持续的。
本研究找到，N-08 的土壤氨水解细菌香农-威纳指数在舒氮条件下的抽穗扬花期和不施氮条件下的拔节期皆明显低于Nipp，其余时期无明显差异。这与Jin 等的研究结果完全一致，其也找到转基因大豆的土壤氨水解细菌香农-威纳指数仅有在收获期明显升高。本研究还找到N-04 与Nipp 的土壤氨水解细菌香农-威纳指数在舒氮和不施氮处置条件下皆无明显差异（除抽穗扬花期外），解释氮高效转基因水稻本身对土壤氨水解细菌的影响也是一段时间的，但有所不同播种处置、有所不同生长期之间土壤氨水解细菌香农-威纳指数差异较小。
这与金凌波等对转基因大豆土壤微生物群落水平的研究结果相近。Heuer 等对并转T4 溶菌酶基因土豆根际微生物群落结构的研究，也找到其主要与季节、栽种地点和年份有关。本文对土壤氨水解细菌均匀度指数的研究找到，在两种可供氮处置条件下，N-08 与Nipp 的土壤氨水解细菌均匀度指数在分蘖期、抽穗扬花期和成熟期皆无明显差异，仅有在拔节期明显高于Nipp。
邵婧鑫、徐广惠也证明了这一现象，其找到转基因大豆的土壤氨水解细菌均匀度指数仅有在生长充沛时期明显高于非转基因品种。董莲华等的研究也找到，并转Bt+CpTI 基因抗虫棉的土壤氨水解细菌均匀度指数在花铃期明显高于非转基因材料，且其余时期皆并未找到显著差异，与本研究结果也完全一致，解释氮高效转基因水稻对土壤氨水解细菌均匀度指数的影响是一段时间的。亚硝化单胞菌科（Nitrosomonas sp.）在硝化作用第一阶段亚硝化作用中起主导作用，可以增进NH4+ 水解成NO2-，具备容许二氧化碳相同的能力，亚硝化螺旋菌科（Nitrosospira sp.）可作为硝化细菌，将亚硝酸盐水解为硝酸盐。
本研究中施氮和不施氮处置下，氮高效转基因水稻（N-04 和N-08）土壤中归属于亚硝化螺旋菌科（Nitrosospira sp.）和亚硝化单胞菌科（Nitrosomonas sp.）的氨水解细菌明显少于Nipp。因此，N-04 和N-08 的栽种不存在增进土壤中铵态氮水解为硝态氮的有可能。本研究对各生长期土壤硝态氮和铵态氮含量也展开了分析（研究结果并未在文中所列），结果找到N-08 和N-04 在生长充沛时期土壤硝态氮含量显然明显低于Nipp，而铵态氮含量明显高于Nipp，也更进一步证明了氮高效转基因水稻的栽种不利于土壤铵态氮向硝态氮的转化成。
4 结论（1）各生长期内氮高效转基因水稻（N-04 和N-08）和非转基因水稻（Nipp）在舒氮和不施氮处置条件下DGGE 指纹图谱多为共计条带。（2）N-04 和N-08 的土壤氨水解细菌香农-威纳指数和均匀度指数仅有在个别时期与Nipp 产生明显差异，解释氮高效转基因水稻本身对土壤氨水解细菌群落多样性的影响是一段时间的。（3）氮高效转基因水稻（N-04 和N-08）土壤中归属于亚硝化螺旋菌科（Nitrosospirasp.）和亚硝化单胞菌科（Nitrosomonassp.）的氨水解细菌明显少于Nipp，解释氮高效转基因水稻的栽种不利于土壤铵态氮向硝态氮的转化成。
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